APOBEC偶聯甲基化捕獲測序（CACE-Seq）
項目介紹
基因組中大約隻有 0.7%的胞嘧啶被羥甲基化修飾，而全基因組測序分析時想要確保分析結果的可信度，測序深度至少達到 30X（人的樣本需要至少90 G 測序數據量），這無疑增加了測序和數據儲存費用以及分析難度。因此基於富集的檢測分析方法既能增通過增加測序深度提高可信度又能有效降低測序成本，能夠很好的解決上述痛點。之前我們開發了全基因組 DNA 羥甲基化捕獲測序方法， 能夠捕獲基因組上約 97%以上的 5hmC 位點，但無法實現單堿基精確度。為此，我們通過對捕獲流程進行改造，最終將單堿基精確度和低數據量兩大優勢集於一體的APOBEC偶聯甲基化捕獲測序（CACE-seq）。
主要流程
訂購信息
測序數據量：10~12 G
測序平台：illumina
周期：30個自然日
測序平台：illumina
周期：30個自然日
對物種有以下要求：
a. 物種為真核生物；
b. 物種具有參考基因組，至少拚接到scaffold水平；
c. 具有較為完整的注釋。
b. 物種具有參考基因組，至少拚接到scaffold水平；
c. 具有較為完整的注釋。
樣品需求
1、細胞：5×10
6以上，收集細胞，PBS 洗兩次，離心後盡量去除 PBS，保留細胞沉澱，封口膜封好，幹冰運輸。
2、組織：100 mg以上，樣品置於1.5 ml EP 管中，封口膜封好，-20℃以下保存，幹冰運輸。
3、gDNA：2 μg以上，濃度大於35 ng/μl（以Qubit定量結果為準），OD260/280=1.8-2.0
2、組織：100 mg以上，樣品置於1.5 ml EP 管中，封口膜封好，-20℃以下保存，幹冰運輸。
3、gDNA：2 μg以上，濃度大於35 ng/μl（以Qubit定量結果為準），OD260/280=1.8-2.0
交付
測序原始數據
實驗結果類文件
分析報告及分析結果文件
實驗結果類文件
分析報告及分析結果文件
分析結果示例
樣品需求
分析內容
1) DNA 羥甲基化富集峰識別
通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域，生工對每個樣品組做一個 Input 對照，以去除基因組背景，降低假陽性率。
圖1 羥甲基化富集區域結果
2) 羥甲基化富集峰注釋
不同的顏色代表不同的基因元件，餅麵積表示落在該基因元件上 5hMC 峰所占百分比。
圖2 5hMC 峰在基因元件上的分布餅圖
3) 差異羥基化區域（DhMRs）鑒定
圖3 DhMRs 火山圖
圖4 DhMRs 基因組分布圈圖
4) 差異羥甲基化區域功能注釋及富集分析
橫軸為功能分類，縱軸為該分類內基因個數（右）及其占被注釋上基因總數的百分比。不同顏色代表不同的分類。 柱狀圖和坐標軸上深色代表關聯基因，淺色代表所有基因。
圖5 關聯基因 GO 注釋分類柱狀圖
縱軸表示功能注釋信息，橫軸表示功能對應的 Rich factor ，Qvalue 的大小用點的顏色來表示，Qvalue 越小 則顏色越接近紅色，每個功能下包含的關聯基因的多少用點的大小來表示。
圖6 顯著富集功能散點圖