所謂“退火（Annealing）”，是指將材料暴露於高溫環境中持續一段時間，再緩慢冷卻到低溫的熱處理步驟。
對於Oligo來講，退火過程的主要目的是用於形成DNA的高級結構，如莖環、發夾、雙鏈或其他結構。
1. 溶解oligo
拿到oligo幹粉產品之後，對管子進行瞬時離心，加入退火緩衝液進行溶解。
推薦溶解成比較高的濃度，建議100 μM以上濃度。如oligo因濃度較高而不溶解，可以加熱並攪拌促溶。
2. 濃度測定&混合
精確測定每個Oligo溶液的濃度，並按照需要的比例進行混合（如等摩爾混合）。如果兩條oligo退火形成雙鏈，摩爾數不同會導致多餘的單鏈殘留。單鏈發夾或莖環的退火可跳過此步驟。
3. 退火
將混合體係加熱至94°C，持續2 min，然後緩慢降溫（一般情況下將至室溫即可）。緩慢降溫對形成正確的結構是非常有幫助的，降溫過快將導致錯誤高級結構的產生，推薦的方法是將混合管放入一杯94°C的水中，讓其自然降至室溫。
4. 稀釋&儲存
降溫之後，可以用退火緩衝液稀釋至需要的濃度並儲存於-20°（長期）或4°C（短期內頻繁使用）。
退火緩衝液的配製
退火緩衝液配方：10 mM Tris, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA
其中：tris起到pH緩衝作用，EDTA起到防止oligo降解的作用，鹽離子對於DNA雙鏈的形成是必要的。
配製退火緩衝液，需要高溫滅菌，並使其中的脫氧核糖核酸酶失活，如果用於siRNA退火，需要保證RNase-free.
適用性
該方法適用於常規oligo、2-甲氧基修飾、鎖核酸等高級修飾的oligo以及短鏈RNA的退火。
退火效率檢測
可以通過非變性PAGE膠對變性前的單鏈oligo以及變性之後的雙鏈oligo同時進行電泳，判斷是否退火成功，通常情況下，鏈長較短時，相同長度的單鏈比雙鏈DNA的遷移速度要快。但長鏈oligo由於其本身容易形成高級結構，不推薦進行非變性電泳。