技術 | qPCR不正常曲線分析
溶解曲線主峰左側有峰
一般考慮是引物二聚體或者短的非特異性擴增，解決手段通常有：
◆ 降低引物濃度
20ul體係正常參考引物用量是10uM濃度 0.4ul
◆ 提高退火溫度
梯度摸索引物退火溫度，一般退火溫度不建議超過63°C
◆ 增加模板濃度
當目的基因表達量極低時，染料法QPCR容易形成引物二聚體產物影響實驗結果，提高模板濃度
◆ 重新設計引物
溶解曲線主峰右側有峰
一般考慮非特異性擴增，去除非特異性擴增的手段有：
◆ 提高退火溫度:
梯度摸索引物退火溫度，一般退火溫度不建議超過63°C
◆ 提取的RNA需要去除基因組DNA汙染，或者
◆ 重新設計引物
ROX添加不當
ROX矯正不當可能形成如下熔解曲線圖
解決手段通常有：
◆ 一定要清楚機器的ROX矯正信息，加的時候一定要看清標簽，高低要分清
◆ ROX要完全融化，混合均勻後再使用
◆ 如果是需要矯正的機器型號但是用了不校正的染料，那麼可以關閉軟件裏麵的ROX矯正選項，重新分析數據
高濃度抑製
◆ 高濃度模板可能存在一些抑製因素，導致擴增產物的減少，稀釋後抑製就降低或者解除了
◆ 所以如果出現這樣的情況可以調整模板濃度，Ct滯後我們也可以調整下稀釋倍數，保證足夠多的標準點。
濃度梯度Ct值異常
◆ 前麵不能出現梯度，原因可能是模板量過高，超出了線性範圍，那麼需要去掉前麵不能分開的梯度，選擇後麵梯度；
◆ 後麵不能出現梯度，原因可能是模板量低，超出了線性範圍，那麼需要去掉後麵這些梯度，重新摸索高濃度梯度。
無擴增曲線
◆ 機器設定：首先要看下程序的設定方麵，如果程序設定錯誤，那麼是采集不到熒光信號的，
（兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段；三步法擴增程序應當將信號采集設置在72°延伸階段）
◆ 循環數：循環數不夠，一般要設置40個循環，但是循環數太多的話會增加背景信號，降低數據的可信度；
◆ 引物降解：可以通過變性PAGE檢測引物是否降解
◆ 引物不合適：重新設計引物
◆ 模板濃度太低： 減少模板稀釋倍數，如果是未知濃度樣品建議從高濃度開始預實驗；
◆ 模板降解：重新製備模板，重複實驗
◆ 表達量低：重新反複設計引物，4-5對不可以放棄該基因
Ct值偏大
◆ 引物不夠好，擴增效率低，重新設計引物或探針；
◆ 優化PCR條件：
- 改用三步法；
- 增加鎂離子濃度（如果用mix應該也調整不了這個濃度）
- PCR各反應成分的降解或加樣量不足
- 擴增片段太長：建議長度80-200bp
◆ 基因表達量低：
若重新反複設計引物仍不能解決問題，可以放棄該基因或使用其他更為靈敏的檢測方法
擴增曲線先下降後上升
◆ 模板濃度太高,基線的終點值大於CT值：
手動設置減小基線終點值,重新分析數據，(默認的基線範圍一般是3~15個循環,如果遇到擴增在10個循環就起來的那麼收到把基線範圍設置到3~5就可以了,或者是CT值前4~5個循環，基線的設置很可能會影響到引物的擴增效率的結果)
沒有對數增長期
◆ 探針部分降解導致的，如反複凍融探針；在光下暴露時間過長都可能引起，需要重新更換引物探針
◆ PCR反應液中有PCR抑製物，如模板濃度過高，模板中有雜質等
某一空的熒光信號 特別強
◆ 試劑製備時沒有充分混勻，各管成分不一樣
◆ 如果是探針法的話，可能是探針沒有融化，有一管中的探針量太多
◆ 也可能是機器原因，不過這個可能性不大
擴增曲線有向上的尖峰
◆ 可能是電壓不穩定導致的，也可能是斷電或者突然開蓋導致的。
山峰形擴增曲線
◆ 反應液蒸發，可能管子沒有蓋好或者管子質量差
標曲標準偏差大於0.5
擴增反應的對數線性期的斜率可用於檢測反應效率。
● 良好的反應效率應在90%-110%之間。
● 擴增效率低於100%，是因為PCR擴增體係中的抑製因素 ,或者RNA有所降解；
● 高於100%是因為非特異性擴增或引物二聚體造成。
解決方案：
◆ 試劑使用前需要徹底融化充分混勻，包括Mix、引物和探針
◆ 使用精確的移液器，加樣時候要垂直加樣
● 擴增信號太弱
● 儀器本身的問題，可能在擴增過程中儀器出現了波動