貼壁細胞樣本的總蛋白提取

1. 倒掉培養液，並將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸幹培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘餘培養液流到瓶底然後再用移液器將其吸走）。

2. 每瓶細胞加3 ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然後棄去洗液。重複以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄淨後把培養瓶置於冰上。

3. 按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置於冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）

4. 每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，於冰上裂解30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

5. 裂解完後，用幹淨的刮棒將細胞刮於培養瓶的一側（動作要快），然後用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）

於4 ℃下12000rpm離心5 min。（提前開離心機預冷）

6. 將離心後的上清分裝轉移到0.5 ml的離心管中放於-20 ℃保存。

哺乳動物組織樣本的總蛋白提取

1. 將100 mg 組織剪切成小塊，加入適量的冰冷PBS 洗滌兩次後，4℃，700×g（3000 rpm) 離心3 min，棄上清。20 mg組織加入100 μl裂解液，置玻璃勻漿器冰上均質30～50次。(如使用組織勻漿機，則按照20 mg組織加入100 μl裂解液的比例加入裂解液。每個試管加入2個直徑2 mm的磁珠。將試管放入組織勻漿機中，60 HZ，300s。充分裂解後，10000 g離心5 min，取上清。)

2. 最大速度渦旋震蕩10 sec，冰上放置20 min，期間取出震蕩3-5次,再於4℃， 12000 rpm 離心10 min，以沉澱組織或細胞碎片，取上清。

生工相關產品——WB樣品製備

RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用於常規的 WB、IP 等。按裂解強度可分成不同類型產品。

對於不同的物種組織、培養細胞或不同細胞結構蛋白，您可以選擇更有針對性的試劑盒。如果您需要節省實驗步驟，加快速度，還可選擇一步法蛋白提取試劑盒。

對細胞進行裂解後，與目標蛋白一起釋放出來的還有蛋白酶和磷酸酶，他們會水解蛋白為多肽或氨基酸。此過程會導致許多重要蛋白的流失，進而嚴重地影響下遊實驗，因此需要在細胞的裂解過程中加入相應的蛋白酶或磷酸酶抑製劑，從而確保目標蛋白的完整性。

BCA法蛋白定量

1. 根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配製適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內穩定。

2. 完全溶解蛋白標準品，取10ul稀釋至100 ul，使終濃度為0.5 mg/ml。蛋白樣品在什麼溶液中，標準品也宜用什麼溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9% NaCl或PBS稀釋標準品。

3. 將標準品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ul加到96孔板的標準品孔中，加用於稀釋標準品的溶液補足到20 ul。

4. 加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用於稀釋標準品的溶液至20 ul。

5. 各孔加入200 ul BCA工作液，37℃放置30分鍾。注: 也可以室溫放置2小時，或60℃放置30分鍾。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。並且顯影反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。

6. 測定562 nm波長處吸光值，540-595 nm之間的波長也可接受。根據標準曲線計算出蛋白濃度。

生工相關產品

10% SDS-PAGE 自製膠電泳步驟

1. 根據蛋白的分子量確定好SDS-PAGE膠的濃度，裝配好灌膠的模具。

2. 進行分離膠的配置，取一個燒杯，按照配方加入適量的聚丙烯酰胺溶液，10% SDS，分離膠緩衝液，混勻。加入適量的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌（注：不要產生氣泡），將此液體緩慢加入到模具內。

3. 加入分離膠後輕輕在分離膠溶液上覆蓋上水。

4. 等待30~60 min，待凝膠聚合後，分離膠和水層出現一個清晰的界麵，吸盡分離膠上的水。

5. 進行濃縮膠的配置，取一個燒杯，按照配方加入適量的聚丙烯酰胺溶液，10% SDS，濃縮膠緩衝液，混勻。按照配方加入適量的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌（注：不要產生氣泡），將此液體緩慢加入到分離膠的上麵，直至灌滿，將梳子插入凝膠內（保證梳子齒末端沒有氣泡）。

6. 等待30 min左右，待凝膠聚合後小心拔出梳子，將製好的凝膠及玻璃板放入電泳槽內並組裝好。

7. 將電泳緩衝液加入內外槽中，使凝膠的上下兩端均能浸泡在電泳緩衝中。

8. 將製備好的樣品與上樣緩衝液按比例混合，95℃~100℃加熱3~5 min，取15 ul(可根據試驗情況進行調整)將樣品加入到凝膠孔中，同時必須在同一片膠的孔中加入蛋白marker作為參照。

9. 接通電源進行電泳，觀察 marker，待 maker顯示的目標蛋白與其他蛋白明顯分離停止電泳，一般情況下是等溴酚藍標記的樣本跑出凝膠，目標蛋白的分子量不同電泳停止的時間不同，視實驗而定。

生工相關產品——預製膠

Precast-GLgel 預製膠用玻璃板作為材質，結合專用的緩衝液，效果完全達到並超越傳統手工 PAGE 膠水平；膠強韌有效防止斷裂；能兼容 Bio-Rad 標準的市麵大部分電泳槽；電泳時間可短至 30 分鍾，且凝膠盒可徒手輕鬆打開，無需起撬工具。

生工相關產品——凝膠製備試劑盒

BBI品牌凝膠預混液，凝膠速度快，使用方便，提供了配製PAGE膠所需的各種試劑，用戶隻需自備製膠器具和蒸餾水，即可配製PAGE膠。

生工相關產品——電泳與上樣緩衝液

生工相關產品——蛋白Marker