全基因組甲基化測序
項目介紹
DNA 甲基化異常往往會引起 DNA 構象、染色質結構及 DNA 穩定性的改變，從而抑製相關基因的轉錄調控，導致多種信號通路包括細胞周期、凋亡、DNA 損傷和免疫識別等路徑發生改變，這種異常的 DNA 甲基化狀態最終容易造成多種疾病的發生，如腫瘤、血管類疾病、神經性疾病等。5mC 在不同類型的細胞和組織中存在顯著差異，在肺癌、腦癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、前列腺癌、乳腺癌和結腸癌等多種癌症組織中的含量均有顯著變化，表明 5mC 在癌症發展中發揮重要作用。DNA甲基化和羥甲基化狀態還可以作為疾病篩查、預防、診斷和預後的重要指標。因此，DNA 甲基化和羥甲基化修飾檢測具有重要的研究意義，其超靈敏檢測能夠為理解疾病發展的表觀遺傳規律和疾病早期診斷提供有力支持。
技術支持
電 話：
021-57072057
021-57072096
021-57072096
E-mail:
genome@sangon.com
genome2@sangon.com
genome2@sangon.com
全基因組 DNA 甲基化測序（Whole Genome Bisulfite Sequencing， WGBS）被視為 DNA 甲基化研究的“金標準”，它通過利用重亞硫酸鹽處理 DNA 導致未甲基化的 C 變成 U 並在後續 PCR 和測序過程中成為 T，而甲基化的 C 不受重亞硫酸鹽的影響，後續對處理後的基因組 DNA 建庫測序，可對整個基因組上的甲基化情況進行分析，具有單堿基的分辨率，可精確評估單個 C 堿基的甲基化水平，覆蓋範圍廣。它可以構建精細甲基化圖譜，建立表觀遺傳學研究數據庫，為後續大規模開展不同樣品間的甲基化差異分析提供參考圖譜。
主要流程
實驗流程
分析流程
送樣要求
樣品需求
1. 原始樣本
1） 全血：單個樣本請至少提供2 ml；
2） 石蠟包埋組織樣本：至少有10~15個切片；
3） 其他樣品請與我公司技術支持聯係。
2） 石蠟包埋組織樣本：至少有10~15個切片；
3） 其他樣品請與我公司技術支持聯係。
2. DNA樣品
1） 濃度≥ 50 ng/μl，總量 1~ 2 μg，以Qubit 2.0檢測結果為準；
2） 樣品純度：OD值260/280應在1.8～2.0；
3） 樣品質量：基因組完整、無降解；
4） 樣品包裝：用封口膜密封樣品，DNA低溫運輸。
2） 樣品純度：OD值260/280應在1.8～2.0；
3） 樣品質量：基因組完整、無降解；
4） 樣品包裝：用封口膜密封樣品，DNA低溫運輸。
常見問題
Q1. 哪些物種可以做全基因組甲基化測序？
目前主要針對有完整基因組序列（拚接到染色體水平）和完整基因注釋文件（包含基因水平，有外顯子、內含子、CDS 等）的真核生物，特殊情況建議反饋物種拉丁名進行項目評估。
Q2. 全基因組甲基化測序每個樣本測多少數據量？
一般每個樣本測30X的數據量，比對小鼠基因組大小約為3 G，那測序數據量為90 G。
Q3. 為什麼WGBS測序的mapping率相較正常的基因組測序低？
WGBS 建庫過程中，Bisulfite 處理將 umC 轉化為 U，mC 維持不變。PCR 擴增後，所有 mC 不受影響，而 umC 變成 T，互補鏈就變成 A；初始的雙鏈 DNA 就變成了四條不同的鏈。采用 Bismark 軟件與參考基因組進行比對，將所有參考基因組和 reads 上的 C 變成 T（另一條鏈 G 變成 A），導致mismapping 的堿基位點較多，mapping rate 降低。
Q4. WGBS 在項目開始之前需要考慮哪些因素？
在項目開始之前需要考慮以下因素：是否為低甲基化率的物種；該物種的基因組完成情況如何（影響 BS-SEQ 的比對）；基因組是否存在複雜因素：GC 含量偏高、雜合度偏高、轉座子、重複區域等。
Q5. WBGS 需要做重複嗎？
一般不需要做樣本重複。
Q6. 可以對無參考基因組的物種進行 Bisulfite 研究嗎？
Bisulfite-Seq 強烈依賴基因組的完成程度，基因質量的好壞直接影響後續的分析結果，因此更適合有完整基因組信息的物種。
案例展示
研究對象：小鼠肝髒組織
樣本數：6個
樣本數：6個
1) 甲基化水平分布分析
不同類型的 C 堿基( CG、CHG和CHH )，其甲基化水平在不同物種間，甚至同一物種不同細胞類型不同條件下其甲基化水平都存在差異。統計每種類型 ( CG、CHG和CHH ) 甲基化 C 的甲基化水平分布，以此來反映該物種 DNA 甲基化特征。
2) 序列特征分析
在一些真核生物中，甲基化位點附近堿基的序列特征，對反映甲基化發生的序列偏向有指導意義。為了研究序列特征與甲基化偏向性之間的聯係，我們分析了 CG 和非 CG 位點的甲基化的 C 附近堿基的分布情況，並統計不同甲基化模式出現的概率。
3) 甲基化密度分布分析
非 CG 型的甲基化與 CG 型甲基化 C 的密度有很大的差異。染色體亞端粒區域 DNA 甲基化水平通常較高，這一現象與端粒長度以及重組有十分重要的作用，繪圖展示單條染色體水平上甲基化 C 堿基的的分布情況。
4) 轉錄元件甲基化水平分布
為了深入地揭示 DNA 甲基化與基因表達的內在聯係，所有編碼基因序列被分成4種不同的轉錄元件區域，在此基礎上對不同轉錄元件區域的平均甲基化水平進行統計。
5) 樣本間距離計算
樣本間的甲基化分布差異程度可通過統計學中的距離進行量化分析，繪圖通過顏色直觀的展現樣本與樣本之間的距離關係。
6) PCA 主成分分析
通過分析不同樣本甲基化水平可以反映樣本間的差異和距離，PCA 運用方差分解，將多組數據的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大反映樣品間差異的兩個特征值。
7) 差異性甲基化區域（DMR）分析
差異甲基化區域（DMRs）是指不同樣品中基因組表現出不同的甲基化模式的某些 DNA 片段。親本與子代甲基化模式的差異常常導致表觀遺傳缺陷，而人工繁殖技術可能會導致異常甲基化的比例升高，並導致疾病的發生。
8) 功能富集關聯分析
功能與基因並不是簡單的一對一的關係，而是複雜的多對多關係。通過關聯分析，構建功能-功能和功能-基因互作網絡，並利用網絡分析的手段識別出關鍵的功能和基因，並基於調控關係來闡明基因和功能的作用機理。
