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測序結果說明

正常
菌(質粒)無信號
菌(質粒)重疊峰
PCR無信號
PCR重疊峰
缺失突變
poly結構
高GC
甲基化序列
發夾結構
信號弱

正常

正常測序峰圖說明	一個測序反應隻能測到1000bp左右。有效堿基(99%準確)在前750bp左右，之後的序列出現寬峰。對於PCR樣品，如果一個反應能測通，那麼正常的測序結果就能夠測到PCR終止末端的那個A堿基。(示意圖是1000bp的PCR片段，高保真酶擴增的產物沒有末端那個A)。對於菌樣或者質粒樣品，由於質粒是環狀的，序列在正常情況下，都不會出現終止。
	測序的熒光信號，是從測序引物之後的第一個堿基開始。所以測序得到的序列，是看不到測序引物的。PCR樣品如果測通了，僅能看到另一端引物的反向互補序列。
	測序信號是熒光信號，請不要送任何幹擾我們熒光信號的樣品或引物。尤其是熒光定量PCR產物。如果該產物進行常規測序。我們均會正常收費。
	所有的序列文件，都是根據測序峰圖導出的。測序結果的好壞，請根據峰圖判斷。

菌(質粒)無信號

測序峰圖說明	序列峰圖雜亂無章，測序幹擾較大，沒有明顯主峰。(示意圖隻提供300bp參考)
測序原因說明	測序模板與引物無法配對，或者配對能力較差，造成測序信號弱甚至無信號。
菌樣無信號說明	菌液濃度太低甚至失活，或者載體為低拷貝，造成提取的質粒濃度低，測序無法產生足夠信號。
	載體的信息錯誤，或者載體經過改造，測序引物與模板無法有效結合，造成測序無信號。
	自己附帶引物，請根據測序反應的多少，保證足量引物，且每次附帶新引物，確保引物沒有降解。引物10ul起送。
解決方法	請提供足夠濃度的新鮮菌液1mL。
	請正確提供載體信息，非常見載體，請提供載體序列及酶切位點。非常見載體，我們公司可能沒有通用引物，或者引物序列不一致，客戶可以提供引物序列。
	若雙向測序，有一端結果正常，另外一端測序結果無信號，可以考慮單向測通。大部分這樣的結果，我們都已針對測序失敗的引物，重新測序過。
質粒無信號說明	客戶自己提供的質粒濃度太低，造成測序結果信號弱，甚至無信號。實際上多數質粒測序失敗，都是客戶提供的質粒質量不高造成。
	載體的信息錯誤，或者載體經過改造，測序引物與模板無法有效結合，造成測序無信號。
	自己附帶引物，請根據測序反應的多少，保證足量引物，且每次附帶新引物，確保引物沒有降解。引物10ul起送。
解決方法	自己提供質粒，樣品濃度請大於200ng/ul，低拷貝質粒濃度要求更高。
	請正確提供載體信息，非常見載體，請提供載體序列及酶切位點。非常見載體，我們公司可能沒有通用引物，或者引物序列不一致，客戶可以提供引物序列。
	若雙向測序，有一端結果正常，另外一端測序結果無信號，可以考慮單向測通。大部分這樣的結果，我們都已針對測序失敗的引物，重新測序過。
典型案例說明	PET係列全部都是低拷貝質粒，測序容易出現信號弱，甚至無信號的情況。
	空載體，如果使用插入片斷的序列作為測序引物，測序結果必然出現無信號的情況。

菌(質粒)重疊峰

測序峰圖說明	序列峰圖從第一個堿基開始一直到測序結束(有時候是很長一部分重疊，不是全部)，測序峰都不是單一峰型，我們稱之重疊峰。有些公司稱之套峰。
測序原因說明	出現重疊峰，說明上機的模板不止一個。也就是我們測序反應完成之後，產生了不止一個模板。簡單的說，就是產生了不止一條序列。
菌樣重疊峰說明	接菌可能汙染了。這個接菌汙染，很有可能是客戶挑單克隆的時候汙染了，尤其是抗性未加。並非我們擴大培養的時候造成的汙染。
	測序引物和模板不止一個結合位點。通用引物並非隻能和載體結合，如果插入片段上有位點，哪怕不是100%結合，也有可能出現重疊峰。
	測序引物降解，尤其是客戶自帶引物容易發生降解。
解決方法	重新挑取單克隆。如果樣品本身不存在問題，可能是引物和模板不止一個結合位點。請嚐試另外的引物進行測序。
質粒重疊峰說明	客戶提取質粒過程中，樣品受到汙染，造成DNA不止一套。
	測序引物和模板不止一個結合位點。通用引物並非隻能和載體結合，如果插入片段上有位點，哪怕不是100%結合，也有可能出現重疊峰。
	測序引物降解，尤其是客戶自帶引物容易發生降解。
解決方法	重新挑取單克隆。如果樣品本身不存在問題，可能是引物和模板不止一個結合位點。請嚐試另外的引物進行測序。
典型案例說明	PETDUET係列載體有兩個多克隆位點，T7也就有兩個結合位點了。T7測序肯定重疊峰。
典型案例說明	非單克隆樣品，也是典型的重疊峰型。非單克隆樣品，測序結果僅載體部分不是重疊峰。

PCR無信號

測序峰圖說明	序列峰圖雜亂無章，測序幹擾較大，沒有明顯主峰。(示意圖的PCR片段隻有280bp)
測序原因說明	測序模板與引物無法配對，或者配對能力較差，造成測序信號弱甚至無信號。
PCR未純化樣品測序無信號說明	樣品濃度太低，造成純化之後的模板濃度太低，測序無法產生足夠信號。
	PCR產物送樣量太少。造成DNA總量太少，純化之後無法產生足夠模板，測序信號弱，甚至無信號。以上兩點是PCR失敗的最主要原因。
	PCR片段大於2000bp時，純化效率顯著降低，造成模板濃度不足，測序信號偏弱。
	測序引物與模板沒有結合位點。
	測序引物或者模板，已經發生降解。
解決方法	請務必提供30uL以上PCR未純化產物。若自行檢測樣品，最多取3uL，檢測到明亮清晰的條帶為準。
	過長的PCR片段，不建議直接測序。請分段擴增，且片段控製在1000bp左右。
	請每次附帶新引物。引物由於稀釋到工作濃度，極易發生降解。長期測序的客戶，請盡量每個星期都能重新送一些引物。引物10uL起送。
PCR已純化樣品測序無信號說明	樣品濃度太低，測序無法產生足夠信號。
	測序引物與模板沒有結合位點。
	測序引物或者模板，已經發生降解。
解決方法	自行檢測樣品，最多取3uL，檢測到比較清晰的條帶為準。由於存在運輸上的不確定因素，實際檢測效果，以我們公司電泳檢測為準。
解決方法	請每次附帶新引物。引物10uL起送。
典型案例說明	由於每個客戶的PCR效果都不一樣，PCR的測序成功率是幾種樣品類型中最低的。如果PCR測序效果始終不理想，請考慮TA克隆之後再進行測序。

PCR重疊峰

測序峰圖說明	序列峰圖從第一個堿基開始一直到測序結束(有時候是一部分重疊，不是全部)，測序峰都不是單一峰型，我們稱之重疊峰。(示意圖的PCR片段隻有350bp)
測序原因說明	出現重疊峰，說明上機的模板不止一個。也就是我們測序反應完成之後，產生了不止一個模板。簡單的說，就是產生了不止一條序列。
PCR未純化樣品測序重疊峰說明	電泳檢測為單一條帶，但PCR產物實際不是純合產物。
	片段差異小於100bp，無法通過瓊脂糖膠切膠分離。甚至檢測不到非特異性。
	上下遊引物混合到同一管進行測序。
	PCR引物與模板有多個結合位點。
	PCR引物已發生降解。
	PCR產物為單引物擴增產物。
解決方法	PCR重疊峰，說明切膠無法分離條帶。請根據實驗目的，考慮TA克隆之後，再進行測序。
PCR已純化樣品測序重疊峰說明	PCR產物為混合物，純化並沒有分離各條帶。
	上下遊引物混合到同一管進行測序。
	PCR引物與模板有多個結合位點。
	PCR引物已發生降解。
	PCR產物為單引物擴增產物。
解決方法	嚐試送PCR未純化樣品，我們幫您純化。或者考慮TA克隆之後，再進行測序。
典型案例說明	幾乎所有的DGGE膠，都無法分離純合條帶。測序結果基本都是重疊峰。
	16srDNA樣品，尤其是27F方向，由於樣品存在突變。測序結果出現重疊峰。且樣品切膠無法分離條帶。
	點突變屬於重疊峰範疇。

缺失突變---成功

缺失突變說明	PCR產物測序時常見的二級結構。菌液、質粒一般不存在，因為挑取單克隆已經去除雜合體。缺失突變樣品均無法測通、拚接。
測序峰圖說明	序列峰圖從某一個位點之後出現重疊峰。峰圖末端出現不止一個代表PCR終止的‘A峰’。
測序原因說明	DNA模板並非純合體,或者DNA是混合物。擴增產物出現長度多態性，且切膠無法分離條帶。缺失的序列以及長度，我們都無法準確得知。
解決方法	缺失突變屬於重疊峰範疇。請將PCR產物TA克隆之後，挑取不止一個單菌落進行測序。
解決方法	從反向測序，僅僅會得到長度互補的位點之後出現重疊峰。

poly結構---成功

poly結構說明	各種樣品類型均會出現的常見二級結構。測通的樣品，無法通過單向測通這樣的序列。雙向測序有可能測通全長並拚接。
測序峰圖說明	序列峰圖出現連續單個堿基重複，造成該結構之後的序列出現重疊峰，甚至反應中斷。尤其polyG、polyC，會造成測序反應中斷。
測序原因說明	poly結構會造成堿基的滑動錯配，導致重疊峰。
解決方法	poly結構雖然屬於重疊峰範疇，但是無法通過分離單克隆來進行測通。隻能嚐試從反方向測到該結構，然後兩個方向的序列嚐試進行拚接。

高GC---成功

高GC說明	各種樣品類型均會出現的常見二級結構。
測序峰圖說明	序列GC含量太高。
測序原因說明	序列GC含量太高，有可能產生回文結構。造成測序反應後弱，嚴重的情況造成測序反應無法有效延伸，序列中斷。
解決方法	兩個方向均可以嚐試進行測序，但是我們無法保證一定能測通。

甲基化序列---成功

甲基化序列說明	近年來流行的二級結構。尤其是針對線粒體的序列。
測序峰圖說明	一條序列GT堿基含量很高，互補的序列是AC含量高。GT含量高的這個方向90%會反應中斷。
測序原因說明	該序列能引起DNA的二級結構，造成測序無法正常延伸，測序反應中斷。
解決方法	從AC含量高的方向測序，也就是測示意圖的互補鏈，基本上100%能測通這個結構。但是TA克隆的客戶請注意，由於TA克隆的不定向性，我們無法保證一個方向就能測通。做線粒體的客戶請注意，線粒體DNA存在高度甲基化，PCR引物有可能特異性很差，且不是每個方向都適合進行測序。
解決方法

發夾結構---成功

發夾結構說明	非常常見的二級結構。
測序峰圖說明	序列峰圖從某一個位點之後突然(或逐漸)出現信號減弱、重疊峰、無信號峰型、反應終止。
測序原因說明	該峰型，我們無法準確告知是哪段序列造成的何種二級結構。但是測序反應由於非正常情況，造成的延伸障礙，使得序列後半部分峰型發生巨大改變。我們都會規定在這種特殊結構之中。
解決方法	發夾結構的樣品，我們均會按比高GC更高一級的標準嚐試測序，有可能無法單向測通。但是也無法保證從另一個方向能測通這個結構。互補的那個序列有可能存在更嚴重的結構，也有可能和甲基化序列一樣，能輕鬆通過。

信號弱

信號弱	介於正常和無信號之間的結果。
測序峰圖說明	測序結果在無信號和正常結果之間，有主峰，但是噪音幹擾很大(並非重疊峰型)，測序信號弱，或者提前中斷。
測序原因說明	測序並不是隻出現正常結果，以及測序無信號的結果。很多測序結果由於樣品濃度太低，測序反應無法正常延伸，序列信號提前減弱，達不到正常結果的標準，我們按信號弱處理。並不一定是測序技術的問題，有可能是樣品本身不太理想。長時間的運輸、溫度，都有可能使樣品發生降解，造成濃度降低。
解決方法	信號弱的樣品，建議重新製備符合要求的樣品。若客戶要求重新測序，如果重新測序對該結果沒有產生任何改善，我們也將對重新測序的結果收費費用。感謝您的理解和支持。